核酸純化常見問題分析之二/質粒提取

發布時間:2017-07-27

1、從柱離心式產品的流行看經典方法的缺點 (或者操作重點)

柱式方法的風行是無法否定的現實。下面通過柱式方法與經典方法的比較,看一看如何注意經典方法的操作重點。

裂解,二者幾乎沒有任何區別。去蛋白質,柱式靠的是柱材料對蛋白質吸附力低這一特點,將蛋白質殘留控制在比較低的水平 (并不是/也不能徹底去除);經典方法最常用的是 PC 抽提,可以將蛋白質去除得更徹底一些。其它大分子雜質 - 如多糖等 - 的去除,柱式的與蛋白質的去除相似,但經典方法中卻沒有如此方便的對應方法。小分子物 (鹽等) 的去除,是柱式方法最優勢所在。如果柱子設計沒有問題,離心后柱子中殘留的液體穩定而少;柱式的洗滌具有“流水洗滌”的效果;柱式中的核酸是不成團塊的 - 這三個特點決定了柱式的洗滌效率比經典的洗滌效率高,所以,柱式純化的核酸純度比較高。

 

2、  應該使用多少菌液?

根據我們的經驗,如為高拷貝質粒(如:pUC118等),使用2 ml培養液與4 ml培養液純化的質粒DNA的收量差別不是很大,可以純化到20-25 μg的高純度質粒DNA。如提取地拷貝質?;虼笥?0 kb質粒,建議使用5-10 ml的菌液(可分幾管收集菌體,按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ,再將離心上清分批轉移至DNA純化柱),吸附和洗脫的時間可以適當延長,洗脫時使用的溶液Eluent應在60℃水浴預熱。高純度質粒小提試劑盒所配硅膠柱的最大吸附量是40 μg,滿足絕大多數實驗所需用量。

 

3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量問題

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的比例是固定的,如果增加或減少用量都請按比例變化,但是一般來說,用量原則是確保能徹底裂解樣品,同時使裂解體系中核酸的濃度適中(具體表現是加入溶液Ⅱ后,能形成澄清的裂解溶液)。濃度過低,將導致沉淀效率低,影響得率;濃度過高,去除雜質的過程復雜且不徹底,導致純度下降。溶液的用量是以樣品中蛋白質的含量為基準的,而不是以核酸含量為基準。

 

4、 溶液Ⅱ操作時要注意的事項

在反應液充分的時候,第一,反應的時間不能過長,長時間的堿性條件會打斷DNA,基因組DNA一旦發生斷裂,只要是50-100 kb大小的片斷,就沒有辦法再被溶液Ⅲ沉淀了;第二,不得激烈振蕩,不然基因組DNA也會斷裂最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入,瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

 

5、質粒質量檢測

將抽提好的核酸直接用于后續的實驗,是唯一可靠的檢測方法;除此之外的檢測方法,都是相對的,而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質量的方法,一是電泳,二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍),該方法還是非??尚诺?;電泳還可以用于估計核酸的濃度,但其準確度與經驗有關;另外,電泳也可能提供某些雜質污染的信息,但是同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度儀不能確保非常準確,而該儀器的靈敏度又非常高,所以,提供的結果并不十分可信。一般講,同時進行紫外和電泳檢測,綜合二者的結果,可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷,所以,即使出現壞的結果能用于后續實驗而好的結果卻不能用于后續實驗,也不用大驚小怪。

 

6、 質粒電泳條帶

瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時,多數情況下你能看到三條帶,但不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA,用EcoRI來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳,就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序,分別是超螺旋、開環和復制中間體(即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩,會有第四條帶,這條帶泳動得較慢,遠離這三條帶,是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是,有時候抽提到的質粒會有7-10條帶,這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈數不同)所致。

 

7、 核酸的保存

純化后的核酸,最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解;其中 RNA 以水為主,DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險;如果操作過程控制得當,DNase 的殘留幾乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA?;旧?,核酸在保存中的穩定性,與溫度成反比,與濃度成正比。

如果溫度合適,保存中核酸發生降解或者消失,首要原因是酶殘留導致的酶解,第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 (RNA 在弱酸性更穩定,而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的,就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點,那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發生反應,達到某種均衡。EP 管的材質,首先可能吸附核酸,其次還可以誘導核酸的結構發生某些變化,如變性。在核酸的濃度比較高時,這個現象可能觀察不到;當核酸濃度很低時,則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸,雖然已經為實驗所證明,但許多實驗人員并沒有將該建議當回事?,F在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現的材料,在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質要好許多,但其化學特征,尤其是對核酸穩定性的可能影響,遠沒有研究透徹。正如現在的質??梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣,其負面產物可能是,抽提的質粒電泳的構型越來越多:除了原來的三種帶型外,還可能出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。

 

8、 核酸抽提中的溫度問題

核酸抽提中的溫度問題,也是一個值得關注的問題。首先要明確的一點是,任何一個溫度條件,對某些方面有利,同時也一定會有不利的一面。如沉淀,低溫操作會提高得率,但也會增加雜質的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好,應該是利弊權衡的結果?;旧?,除了一些特殊的步驟,如消化等外,用室溫是最好的選擇。低溫的確可以減低酶的活性,但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度,此消彼長,沒有辦法給出結論的。


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