如果不慎發生污染情況,該怎么辦?

發布時間:2017-07-27

如果不慎發生污染情況,應從下面幾條出發,逐一分析,排除污染。
(1)設立陰陽性對照:有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時,應選擇擴增弱,且重復性好的樣品,因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列,反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照,100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重,因為PCR敏感性極高,可以從其它方法(Sourthern 印跡或點雜交等)檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外,每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照,即包括PCR反應所需的全部成分,而不加模板DNA,這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果,就是某一種或數種試劑被污染了。此時,要全部更換一批新的試劑進行擴增,擴增時設立不同的反應管,每一管含有一種被檢測試劑,在檢出污染試劑后,應馬上處理。
(2)環境污染:在排除試劑污染的可能性外,更換試劑后,若不久又發現試劑被污染了,如果預防措施比較嚴密,則考慮可能為環境污染。 
環境污染中常見的污染源主要有:
  ①  模板提取時真空抽干裝置;
  ②  凝膠電泳加樣器;
  ③  電泳裝置;
  ④  紫外分析儀;
  ⑤  切膠用刀或手術刀片;
  ⑥  離心機;
  ⑦  冰箱門把手,冷凍架,門把手或實驗臺面等;
此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源;0.1ml去離子水浸泡;取5ml做PCR實驗;電泳檢測結果。
  ⑧  氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗,仍不能查找到確切污染源,則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的,此時就應該更換實驗場所,若條件不允許,則重新設計新的引物(與原引物無相關性)。

 確定污染源后怎樣處理?


(1)環境污染
1. 稀酸處理法:對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡,使殘余DNA脫嘌呤;
2. 紫外照射(UV)法:紫外波長(nm)一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時,要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布,UV照射僅對500bp以上長片段有效,對短片段效果不大。UV照射時,PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體,這些二聚體可使延伸終止,但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長,嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上,形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基,其他非二聚體的光照損傷(如環丁烷型嘧啶復合體,胸腺嘧啶乙二醇,DNA鏈間與鏈內的交聯和DNA斷裂等)均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點(0.13/堿基)在DNA分子上隨機分布,一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點,那么,105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反,如果100bp的片段,每條鏈上僅有6處損傷,105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。
(2)反應液污染 
可采用下列方法之一處理:
1. DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室溫反應30 min后加熱滅活,然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列;
2. 內切酶法:選擇識別4個堿基的內切酶(如Msp I和Taq I等),可同時選擇幾種,以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷,室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR;
3. 紫外照射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射,注意事項與方法同上述UV照射法;
4. g射線輻射法:1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質粒分子,4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。
(3)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好,而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右,因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1. 原理:在PCR產物或引物中用dU 代替dT。這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育,因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵,可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶,而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
2. dUTP法:用dUTP代替dTTP,使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前,用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活,因此不會影響含dU的新的PCR產物。
3. dU引物法:合成引物時以dU 代dT,這樣PCR產物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后,引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段(1-2kb以上)的擴增用dUTP法效率較用dTTP低,而用dU法就可克服這一缺點。dU引物最好將dU設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4. 優點:可以去除任何來源的污染;UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行;由于擴增產物中有大量dU存在,可徹底消除污染源。
5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響,在進行PCR產物克隆時,應該轉化UNG-(UNG缺陷)大腸桿菌受體菌,否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。                                                                                     (4) 固相捕獲法
用于去除標本中污染的核酸和雜質,原理如下:1)用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交,雜交區域是非擴增區;2)用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸,通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質;3)洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第2)步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。
(5)RS-PCR法(RNA-specific PCR
也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法,該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物,逆轉錄引物的3ˊ端(A區)有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列,5ˊ端2 0個核苷酸(C區)為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后,經超速離心使 cDNA與多余引物分開,再用和第二引物(C)以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA,而污染的DNA或質粒DNA才不會被擴增。
(6)抗污染引物法
該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中,在重組質粒中,這一區域分成兩個區域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本,也不能擴增出任何條帶,即使出現了擴增帶,其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增,因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的,該法試用于環狀靶分子系列。

 


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